Due test LAMP indipendenti per l’identificazione rapida del minatore fogliare serpentino Liriomyza huidobrensis (Blanchard, 1926) (Diptera: Agromyzidae) in Australia

Le larve del minatore fogliare si sviluppano e si nutrono del tessuto del parenchima tra le superfici fogliari delle piante ospiti, lasciando dietro di sé caratteristici tunnel minerari e depositi di rame. I minatori fogliari possono avere un impatto negativo sulla salute della pianta ospite riducendo la fotosintesi fogliare, aumentando la decomposizione delle foglie e consentendo alle malattie di penetrare negli ospiti.¹. I comportamenti di estrazione delle foglie si sono evoluti in quattro ordini di insetti e sono presenti in nove famiglie di mosche delle piante. Sono diffusi nella maggior parte delle 3.163 specie di Agromyzidae Fallén, 1823 che complessivamente nutrono più di 140 famiglie di piante ospiti.^2,3,4. Vari Agromyzidi sono considerati parassiti agricoli, alcuni dei quali sono altamente polibatterici nelle piante ospiti di importanza economica e sono quindi parassiti significativi di importanza quarantena per il commercio internazionale. Liriomyza huidobrensis (Blanchard, 1926), L. sativa Blanchard, 1938f L. trifolii (Burgess, 1880) sono molto diffusi tra questi importanti parassiti.

Queste tre specie di minatori fogliari si sono evolute nelle Americhe, ma sono parassiti endemici nella maggior parte degli altri continenti, inclusa l’Australia, dove ciascuna si è recentemente insediata in aree diverse^5,6,7. Sono collettivamente classificati al numero 20 nell’attuale elenco nazionale australiano dei parassiti delle piante prioritarie⁸. È riconosciuto che ciascun parassita rappresenta una grave minaccia per la produzione di una varietà di colture orticole e ornamentali economicamente importanti. in particolar modo, L. hoedoprinsis, noto come minatore fogliare serpentino (qui denominato SLM), è stato introdotto durante il monitoraggio del 2020 nell’area metropolitana di Sydney, nel Nuovo Galles del Sud, come nuovo parassita invasivo. L’SLM provoca estesi danni fogliari alle colture orticole commerciali coltivate nella regione, tra cui fagioli, cetrioli e verdure a foglia asiatiche.⁷.

La SLM può colpire un’ampia gamma di piante ospiti agricole e ornamentali ed erbe infestanti in Australia⁷molti dei quali sono host utilizzati dagli altri due forniti Lyreomeza Parassiti in Australia⁹. La possibilità di questa diffusione Lyreomeza I parassiti nei diversi sistemi e regioni agricoli ed ecologici dell’Australia sono numerosi⁹. Le industrie agricole e ornamentali interessate dovranno successivamente sviluppare strategie integrate di gestione dei parassiti per affrontare ciascun parassita in base alla sua biologia e alle interazioni con gli ospiti e altre specie di minatori fogliari.^10,11,12,13. In questo contesto, l’identificazione corretta e rapida delle specie di SBM in condizioni di campo è fondamentale per il controllo tempestivo e la gestione dei focolai, soprattutto se la SBM si diffonde in nuove aree o su nuove piante ospiti.

Ce ne sono 18 che esistono naturalmente Lyreomeza Specie in Australia¹⁴. Le specie endemiche di minatori fogliari spesso non sono parassiti di importanza agricola. Gli eventi segnalati per la maggior parte di queste specie sono rari o segnalati solo storicamente (vedi Atlas of Living Australia; https://www.ala.org.au/). L’identificazione diretta delle specie di minatori fogliari sul campo è difficile e soggetta a errori dell’osservatore. Le mine fogliari facilmente osservabili sulle piante ospiti indicano la presenza di attività minatrice fogliare parassitaria. In alcuni casi, la struttura delle mine e l’identità dell’ospite possono essere indicativi di un particolare tipo di parassita^7,15,16. L’identificazione visiva sul campo delle specie Agromyzid adulte di minatori fogliari non è pratica a causa delle loro piccole dimensioni (gli Agromyzid variano da 0,9 a 5,6 mm) e della sottigliezza dei caratteri morfologici utilizzati per diagnosticarli. Molte specie di Agromizidi mancano di una descrizione formale e la maggior parte delle specie descritte può essere distinta dai loro fratelli solo da alcuni caratteri morfologici osservabili. Inoltre, le femmine adulte e gli Agromyzidi allo stadio iniziale generalmente mancano di caratteristiche specie-specifiche e la maggior parte delle identificazioni delle specie si basano sull’anatomia dei maschi adulti e sull’esame microscopico dei loro organi riproduttivi. Tipicamente, durante il monitoraggio dei minatori fogliari nocivi, l’identificazione delle specie richiede esami tassonomici di laboratorio di mosche maschi adulti catturati direttamente sugli ospiti o allevati da stadi di minatori fogliari campionati da piante ospiti colpite. Lo sviluppo dall’uovo all’adulto misurabile in questi ultimi casi può richiedere dai 15 ai 30 giorni^17,18Ciò può ritardare l’allarme di un parassita prioritario e le successive risposte gestionali.

In alternativa, i metodi di genetica molecolare possono fornire l’identificazione a livello di specie delle mosche minatori fogliari e dei principali parassiti agromisidi. Il citocromo mitocondriale viene ereditato dalla madre C Il gene della subunità I dell’ossidasi (COI) è emerso in modo prominente come locus bersaglio per il riconoscimento molecolare di alcune specie di Agromizidae economicamente importanti.^19,2021. Sequenza nucleotidica della regione del codice a barre del DNA COI 5′.²² È stato segnalato che campioni collegati a campioni documentati identificano i geni di importanti specie di parassiti minatori fogliari^19,23. Questi riferimenti di sequenza hanno costituito la base per l’ulteriore sviluppo di metodi diagnostici genetici in vitro e/o la necessità di un’identificazione invasiva Lyreomeza Parassiti in Australia^24,25 E in altri posti^20,26,27. Sequenze genetiche codificate nel nucleo, inclusi 28S e carbamoil-fosfato sintetasi 2 (CAD), riportate per analisi filogenetiche di alcuni agromicidi³ E Lyreomeza²⁸ Fornire ulteriori vantaggi per l’identificazione delle specie di minatori fogliari nocivi. Per identificare i codici morfologici è stata utilizzata l’analisi comparativa delle sequenze di loci mitocondriali e nucleari ereditati in modo indipendente Lyreomeza Classificare²⁸e testare la direzione dell’ibridazione tra specie strettamente imparentate Lyreomeza Classificare²⁹. Recentemente è stato sviluppato un metodo di identificazione molecolare basato sulla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). L. hoedoprinsis²⁷soddisfacendo l’urgente necessità di Lyreomeza Biosicurezza. Tuttavia, questo metodo qPCR è stato testato solo su un numero limitato di specie non bersaglio e necessita ancora di validazione per confermarne l’applicabilità in Australia.

I metodi genetici utilizzati per identificare i tipi di lesioni, come la qPCR e il sequenziamento dei nucleotidi, possono richiedere ore o giorni di elaborazione in laboratorio. Questo ritardo, unito alla consegna e alla registrazione dei campioni nei laboratori, aumenta il tempo necessario per fornire un’identificazione accurata e un allarme potenziato della presenza dell’organismo nocivo. La diagnosi genetica rapida sul campo è preferibile per test rapidi per confermare sospette intercettazioni SLM, ma attualmente questi sistemi sono nelle prime fasi di sviluppo o richiedono hardware sostanziale e/o costoso.

L’amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è una tecnica a basso costo per la conferma e/o il rilevamento di organismi bersaglio³⁰. LAMP comprende una serie di primer specificatamente abbinati al DNA dell’organismo bersaglio ed è progettato per amplificare rapidamente le copie legate del DNA bersaglio. LAMP è particolarmente adatto per identificare le specie di insetti nocivi target sul campo, poiché può testare lisati di DNA grezzo eseguiti su apparecchiature a basso costo per una semplice indicazione visiva dei risultati dei test positivi e negativi.³¹.

Qui riportiamo il nuovo sviluppo e la convalida di test LAMP sensibili per l’identificazione rapida e specifica di SLM, rispetto a una selezione di specie di minatori fogliari campionati durante le recenti indagini SLM in Australia. Inoltre, riportiamo le modifiche dei test per consentire una visualizzazione cromatografica semplificata sul campo dei risultati del test SLM LAMP.